强力土壤总RNA提取试剂盒 中文说明书

RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit

强力土壤® 总RNA提取试剂盒

 

操作步骤更新：

l  （步骤3-5）酚氯仿（pH6.5-8.0，[用户自备]）从原来5min涡旋震荡后加入，改为涡旋振荡前加入。

l  （步骤12）步骤12的孵育改为在室温下进行。若原来-20℃温度下孵育能获得理想得率，你可维持原温度孵育。

 

简介

RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit专门设计用于提取土壤微生物总RNA。试剂盒性能优越，能始终如一地去除腐植酸、富哩酸等RT-PCR抑制因子获得纯净的，可直接用于RT-PCR分析的高质量纯净RNA。通过RT-PCR扩增RNA，证明包括堆肥、底泥、粪肥等富含有机物的各种类型土壤，使用此试剂盒均能体现微生物结构完整性。使用LifeGuard™ Soil Preservation Solution能在采集用于RNA提取的土样后，运输保存过程中，保持细菌存活的同时使其与处休眠状态。无论从什么地方采集土样，抑制RNase 和DNase的活性可保证cDNA的全长合成，以及16s rRNA profiling。LifeGuard™可保持微生物群落结构，-20℃ 30天，4℃ 2星期，室温 1星期。室温下保持RNA完整性30天。我们不建议用RNALater或RNAProtect保护土壤核酸。

 

操作预览

土壤微生物多样性的动态性根据微生物群落族群及其新陈代谢状态变化而变化。影响因素有土壤的成分、含水量、日光照射、可利用养分等环境条件。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit设计可提取土壤微生物及微动物总RNA，包括休眠、正常代谢及死亡的微生物。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit可以提供完整的土壤微生物群落结构图及RNA成分表。

此试剂盒仅供研究用途，非诊断用。

 

相关产品	货号	数量
RNA PowerSoil® DNA Elution Accessory Kit	12867-25	25 preps
LifeGuard™ Soil Preservation Solution	12868-100 12868-1000	100ml 1000ml
UltraClean Agarose, Molecular Biology Grade	15003-50 15003-100 15003-500 15003-1000	50g 100g 500g 1kg
UltraClean®PCR Clean-Up Kit	12500-50 12500-100 12500-250	50 preps 100 preps 250 preps

新产品！试用我们的LifeGuard™ Soil Preservation Solution(MO BIO 货号：12868-100)

室温下运输或保存土样样品期间保护核酸稳定长达30天！

 

重要提示：此试剂盒需要用户自备酚/氯仿/异戊醇溶液（25:24:1， pH6.5-8.0）可从Amresc，Incorporated或 VWRInternational公司购买（见"酚/氯仿/异戊醇供应商"名单），或用户自制。

注意：苯酚及酚/氯仿/异戊醇容易被氧化呈现黄色或粉红色，指示该溶液不再适合用于RNA提取。使用带颜色的酚/氯仿/异戊醇可能会影响最终RNA的质量。使用前存放于干净的容器中，旋紧盖子并避光4℃保存，以延长保质期。

 

设备要求：

15ml管离心机（2500g）

微型离心机（13000g）

移液器（20μl~1000μl）

移液器（1ml & 10ml）

水浴加热设备（45℃，可选）

Vortex-Genie®2 涡旋仪（MO BIO货号#13111-V-220）

涡旋仪适配器（MO BIO货号#13000-V1-15）

 

需要但不提供的试剂

苯酚：氯仿：异戊醇溶液

 

试剂盒组分

	货号：12866-25
组分	量
Bead Tubes (with 1.5g beads)	25
Bead Solution	69ml
Solution SR1	7ml
Solution SR2	22ml
Solution SR3	42ml
Solution SR4	165ml
Solution SR5	110ml
Solution SR6	28ml
Solution SR7	3ml
RNA Capture Columns	25
15ml Collection Tubes	100
2.2ml Collection Tubes	25

△实验前请先逐一检查试剂!

 

购买现成酚氯仿溶液

厂家名称	试剂名称	货号	体积（ml）
Amresco, Incorporated	Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol	0883-100	100
Amresco, Incorporated	Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol	0883-400	400
VWR International	Phenol: Chloroform premixed with Isoamyl Alcohol 25:24:1	100513-510	100
VWR International	Phenol: Chloroform Buffered Solution 25:24:1	IB05174	400

 

保存

组分室温（15-30℃）保存。

 

操作步骤：

1、加入2g土壤样品到一个Bead Tubes（试剂盒提供）中。注意：参考疑难点关于土样加样量问题。

2、加入2.5ml Bead Solution、0.25ml  SR1溶液、0.8ml SR2溶液到Bead Tubes，涡旋混匀。

这一步发生了什么：缓冲液Bead Solution可分离微生物细胞与土壤成分。SR1溶液含有SDS以及其它用于细胞裂解的试剂。SDS作为去垢剂，能破坏细胞膜上的脂肪酸、脂质。SR2溶液为沉淀溶液，可去除腐殖质、细胞碎片及蛋白质等非DNA的有机、无机成分。有机及无机成分的污染会影响到最终RNA的质量并抑制下游RNA实验。涡旋振荡是样品均质化和细胞裂解的关键步骤。

注意：温度过低时会产生沉淀。60℃水浴可重溶SDS，并可趁热使用。

3、加入3.5ml 酚/氯仿/异戊醇溶液（pH6.5-8.0，[用户自备]），涡旋混匀直至分离层消失。

这一步发生了什么：加入酚氯仿可获得最佳裂解效率和得率。裂解的细胞组分留在了有机相，蛋白变性。

4、把Bead Tubes固定在涡旋仪适配器（货号13000-V1-15）上，最大转速（3200rpm）涡旋连续振荡15min。

这一步发生了什么：微生物细胞在1-3步化学（裂解缓冲液）和机械（涡旋振荡）力共同作用下崩解。使用MO BIO的适配器是均质化样品、裂解细胞的最经济方法。你也可以用胶带把Tube管固定在涡旋仪3.5英寸橡胶平板上。不过需要注意的是，胶带会在涡旋振荡过程中会松脱，造成裂解效率下降，样品间结果不统一或得率不高。

5、取下Bead Tube，室温下2500g离心10min。

这一步发生了什么：离心使得相位分离，最终可见三个分离层。最下层含有蛋白、细胞碎片，中间层含有腐殖质及其他有机无机成分，最上层含有总核酸。注意：中间层的厚薄决定于样品类型，富含有机质的样品会形成更厚的中间层。

6、小心地把Bead Tube从离心机取下，转移上分离层（避开中间层及底部分离层）到一个干净的15ml收集管中（试剂盒提供）。中间层的厚薄视样品类型而定。Bead Tube中余下的酚/氯仿/异戊醇溶液弃于专用废液回收容器中。注意：富含无机物的土壤，中下分离层可能比较厚实，需要用枪头刺入底部苯酚层。

这一步发生了什么：含有总核酸的上分离层被转移到了一个新的Tube管中。留下细胞碎片、蛋白质和其它有机成分。注意转移上分离层时避免吸到中间或底层溶液。

7、加入1.5ml SR3溶液到水相分离层，涡旋混匀。4℃孵育10分钟。

这一步发生了什么：第二次使用沉淀剂进一步去除蛋白质、细胞碎片。

8、室温2500g离心10min。避开沉淀小球，转移上清到一个干净的15ml 收集管中（试剂盒提供）。

这一步发生了什么：含有核酸的上层溶液转移到了一个新的15ml 收集管中。剩下非核酸成分。

9、加入5ml SR4溶液到含有上清液的收集管中，上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。室温孵育30min。

注意：原来的操作说明是-20℃孵育30min。若你的土壤类型在-20℃下孵育能获得理想的得率，请按照原方法进行。

10、室温2500g离心30min。

11、轻轻倒掉上清，把15ml收集管倒扣于一张吸水纸上，停留5分钟。

注意：根据土壤类型，底部沉淀可能更大或更黑。

这一步发生了什么：SR4为100%异丙醇。核酸形成沉淀后，弃去异丙醇。

12、SR5使用前先摇匀。加入1ml SR5溶液到15ml 收集管中。充分重悬沉淀。（注意：根据土壤类型，沉淀物有可能难于重悬。可45℃水浴10min，再稍微涡旋。重复直至充分重悬沉淀物。

这一步发生了什么：SR5为专利的盐溶液，可重悬步骤14沉淀下来的核酸。同时平衡RNA capture column滤膜，为步骤16的冲洗和步骤20的洗脱做准备。

13、每个RNA样品制备一个RNA capture column（试剂盒提供）：

a. 取下RNA capture column（试剂盒提供）的帽子，把RNA capture column放入一个15ml 收集管中。Column悬挂于15ml 收集管中。

b. 加入2ml SR5溶液到RNA capture column中，让其自然流下，收集在15ml 收集管中。（注意：下一步加样前勿让column风干。

14、把步骤15获得的RNA提取物加到RNA capture column中，让其自然留下，收集在15ml 收集管中。

15、再加入1ml SR5溶液 冲洗RNA capture column。让其自然留下，收集在15ml 收集管中。

这一步发生了什么：加到RNA capture column中的核酸选择性吸附到column滤膜上。再加1ml SR5为了冲洗未被吸附的杂质，准备RNA洗脱。

16、把RNA capture column转移到一个新的15 ml 收集管中（试剂盒提供）。SR6使用前摇匀。加1ml SR6溶液到RNA capture column中洗脱RNA。让SR6自然流下收集在15ml收集管中。

这一步发生了什么：SR6洗脱缓冲液为专利的盐溶液，可选择性地把RNA从column滤膜上洗脱下来，留下DNA、残留的细胞碎片及抑制因子等。注意：一款新的试剂盒（货号：12867-25）可把剩余的DNA洗脱下来。

17、把洗脱下来的RNA转移到一个2.2ml收集管（试剂盒提供）中。加入1ml SR4溶液。至少上下颠倒一次混匀。-20℃孵育10min。

18、室温13000g离心15min，沉淀RNA。

19、弃去上清，把2.2ml收集管倒扣在吸水纸上晾干10min。

这一步发生了什么：SR4为100%异丙醇。洗脱的RNA沉淀、离心、晾干，然后重悬浓缩。

20、使用100μl SR7溶液重悬RNA沉淀物。

这一步发生了什么：SR7为RNase/DNase-Free水，用于重悬沉淀的RNA。SR7不含EDTA。此时RNA可直接用于下游实验。为了延长RNA的保存时间，可用10mM Tris pH8.0代替SR7重悬RNA。
（注意：对于大多数类型土样，最终RNA中携带的DNA并不明显。而有机物含量特别高的样品有可能增加DNA的污染。对DNA污染比较敏感的情况下，可使用经过检测的引物做PCR扩增。琼脂凝胶显示有DNA条带的话，请参照疑难点中的DNase处理。）

 

LifeGurad™ Soil Preservation Solution操作说明

1、每克土样加入2~2.5倍体积的LifeGurad™ Soil Preservation Solution。如1g土样加入2~2.5ml LifeGuard™。若采样时直接把土壤加入到RNA PowerSoil™的 15mlBead Tube，2g土样分量加5ml LifeGuard™。

注意：若处理的是沉积物等水分含量较高的样品，每克样品请加入3倍体积的LifeGuard™。

2、涡旋或手动摇匀，使所有土样完全润湿。此时LifeGuard™溶液页面应该高于土样。

3、根据实际条件-20℃、4℃或室温保存样品。提取 RNA前2500g离心5min，移除LifeGuard™溶液。

4、若直接使用15ml Bead Tube收集样品，离心去除LifeGuard™溶液后直接进入RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit说明书步骤二继续。

 

使用LifeGuard™保存的各种类型不同生物量和水分含量土壤已经成功通过测试。沉积物水份含量较高会稀释LifeGurad™，需要更大的体积比（3:1）。

生物量对在不同温度条件下LifeGuard保存微生物群落结构的性能影响很大。对生物量未知或周围环境温度超过一般室温（22-25℃）的情况下，应转移到-20℃或4℃，或加大LifeGuard™使用比例（＞2.5ml LifeGuard/ g 土样）。长时间运输或保存土样（超过30days），请于-20℃保存土样。

 

疑点难点

土样类型和加样量

最终RNA的得率和纯度取决于处理的土样类型。RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit经过验证适合处理各种类型不同物理、化学、生物特性的土样。根据我们的经验，对于大多数样品最多加样2g。高有机物含量的样品，加样1g能更好地平衡RNA得率与DNA污染。

沉积物可稍微多加样，我们曾经最多加样5g。提取过程中，步骤12 SR4使用量可增至与裂解物体积一致（注意计算SR4消耗量）。

有些土样或沉积物盐分含量较高，步骤13中可见明显的的白色或黄色盐沉淀。此沉淀会减少核酸提取得率。为了克服盐沉淀，加入SR4后可室温孵育30min，取代原来的-20℃孵育。其它操作步骤不变。

 

酚/氯仿/异戊醇液相分离

为了保证酚/氯仿/异戊醇与水相充分分离，步骤7要在室温下2500g至少离心10min。离心后，中间层的厚薄视土样有机物含量多寡而不同。转移上清时必须避免吸取中间层及底层。若吸取到了中间层或底层，重新离心已转移的水相层一遍，分离水相层。或往混有苯酚/中间层的水相中加入等体积（2ml）氯仿，上下颠倒数次或涡旋混匀，室温2500g离心10min。转移上层水相，弃去下层苯酚/氯仿层。

 

SR5重悬沉淀

高有机物含量的土样获得的RNA沉淀可能难于重悬。45℃水浴加热RNA沉淀有助于重悬。用枪头搅动沉淀或涡旋也能辅助重悬。进入步骤17加样到column前必须充分重悬RNA沉淀。未能充分重悬RNA沉淀会减少RNA吸附，降低其自然下流的速度，导致RNA损失。

 

Column冲洗洗脱

RNA Capture Column中液体只能通过重力流下，不能使用离心机或真空泵抽吸。

 

使用RNase-Free DNase消化RNA

注意：只有RNase-Free DNase才使用于本操作说明。RNases的存在会消化掉RNA。

对于绝大多数类型土样，RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit不存在DNA污染。但高有机物含量的土样，仍有可能提取RNA的同时带有DNA污染。请把下文操作说明与DNase生产厂家的说明书结合，处理RNA。

a. 若一次处理RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit得到的所有RNA，加入4单位的DNase，加入适当的DNase缓冲液和水，定容至200μl。通常10X DNase消化缓冲液为含10mM CaCl2、10mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5。

b. 37℃孵育30-45min。

c. 计入200μl酚/氯仿/异丙醇（pH6.5-8.0），涡旋混匀。室温孵育5min

d. 10000g离心5min。

e. 小心转移上层液相到另一Tube管中。

f. 加入1/10体积的5M NaCl，2倍体积的100%乙醇，上下颠倒混匀。

g. -20℃孵育30min，10000g离心10min。

h. 弃去上清，晾干沉淀小球。

i. 使用与沉淀一样体积的SR7重悬小球。此时RNA可不用稀释直接用于RT-PCR等下游实验。

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更多实用技巧请参阅http://www.anbiosci.com/MBweibo/blog.htm