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获取粪便、植物组织、水样、生物薄膜miRNA

来源:深圳市安必胜科技有限公司 转载请注明出处【2013-06-21】

我们知道许多客户喜欢筛选某些特定的RNA。因为,大多数关于RNA方便的技术咨询涉及到希望保留或者去除特定种类的RNA。虽然并不是每次都能获得你想要的RNA,但只要在提取过程中稍作调整,可能就能获得你说需要的,在之前的一篇文章中,我们已经讨论了如何在使用我们的组织提取试剂盒时保留小片段RNA

许多客户已经开始把研究方向转向提取复杂样品(又叫dirtier)的RNA,我们觉得,是时候介绍一下我们最新的RNA试剂盒了:PowerMicrobiome RNAPowerPlant RNAPowerWater RNAPowerBiofilm RNA。这四款试剂盒都同样使用了两种溶液的混合物来把细胞裂解物中的RNA绑定吸附到硅胶离心柱上。就是这两种溶液的比例决定了被绑定吸附的RNA的分子量,已经最后被提取出来的RNA的大小。小于临界点大小的所有RNA会被冲洗掉。分子量大于临界点的RNA会留在离心柱上,最后被洗脱下来。你可以调整绑定液来改变临界点,但你肯定会丢失掉小于临界点的所有小分子RNA。

那如何应用在实际操作中呢?首先,我们先来了解一些细胞中RNA的类型与大小。核糖体RNA(rRNA)是你能提取的最丰富的RNA类型。因为,它在每个细胞的总RNA中占80%。在原核细胞中,你可以找到三种不同的rRNA:23S (2906 nt)、16S (1542 nt) 和 5S (120 nt)。真核细胞中分别是:28S (5070 nt)、18S (1869 nt)、5.8S (156nt) 和5S (121 nt)。若用跑1%琼脂糖凝胶电泳,你能看到两条平行的rRNA亮带。细胞中第二丰富的RNA(~15%)是转运RNA(tRNA)。tRNA在核糖体中用于把密码子翻译成氨基酸顺序。通常很小,只有70-90个核苷酸。

第三样常见的RNA,也可能是我们客户常关注的信使RNA(mRNA)。mRNA是用于把遗传密码从基因组传递到核糖体用于蛋白合成。一次它的平均分子量因要编码的蛋白不同,大小差异较大。平均大小是2000个核苷酸,你也能找到小至500,大至14000的。不幸的是,如此宽的范围使得我们无法通过大小来进行筛选。电泳上,只能跟rRNA混在一起成弥散状。细胞中余下的RNA,包括microRNA(miRNA,~22核苷酸),在真核细胞中用于基因调控,或者小分子干扰RNA(siRNA,20-25bp),可阻止某些基因的表达。

好吧,这里是独家消息。如果按照说明书标准操作,你提取到的都是大于60个核苷酸的RNA。这意味着你得到了rRNA、mRNA或tRNA,但丢掉了miRNA和siRNA。为了获得这部分更小的RNA,你需要使用可选的吸附绑定混合溶液来减少RNA分子的剪切。标准的绑定液是由一份体积的绑定溶液(不同试剂盒,有可能是PM3、PR3、PWR3或BFR4),1体积100%乙醇,1体积裂解物,组成1:1:1混合物。为了减少RNA分子的剪切,你需要增加一份100%乙醇,混合物比例变成1:2:1。这样,你就可以回收到样品中的绝大部分RNA了。相反,若要增加RNA分子的剪切,则把混合物中的那份100%乙醇换成70%乙醇。这样你就可以只回收mRNA和两倍大的rRNAs了。如果你在研究mRNA,这样就能一定程度上减少背景RNA干扰。

你可能已经有点迷糊了,所以我们做了个简易图表来帮助理解。你可以根据不同试剂盒选择相应的吸附绑定方法。这些试剂盒都已经包含了我们最厉害的因子去除技术(IRT)。请注意,这些技术不能应用于我们的RNA PowerSoil Kit或者UltraClean Microbial RNA Kit。若还有其它疑问,请联系我们。

参考文献:

Molecular Cell Biology. 4th edition. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. New York: W. H. Freeman; 2000.

RNA Isolated

mRNA,16S/23S rRNA

tRNA,mRNA, 5S/16S/23S rRNA

miRNA,siRNA, tRNA,mRNA, 5S/16S/23S rRNA

PowerMicrobiome
Binding Mixture

1 vol PM3
1 vol 70% EtOH
1 vol lysate

1 vol PM3
1 vol PM4
1 vol lysate

1 vol PM3
2 vol 100% EtOH
1 vol lysate

PowerPlant
Binding Mixture

1 vol PR3
1 vol 70% EtOH
1 vol lysate

1 vol PR3
1 vol PR4
1 vol lysate

1 vol PR3
2 vol 100% EtOH
1 vol lysate

PowerWater
Binding Mixture

1 vol PWR3
1 vol 70% EtOH
1 vol lysate

1 vol PWR3
1 vol PWR4
1 vol lysate

1 vol PWR3
2 vol 100% EtOH
1 vol lysate

PowerBiofilm
Binding Mixture

1 vol BFR4
1 vol 70% EtOH
1 vol lysate

1 vol BFR4
1 vol BFR5
1 vol lysate

1 vol BFR4
2 vol 100% EtOH
1 vol lysate

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